Sauerstoff-sensitive Mikrokavitätenarrays

O₂-sensitive Mikrokavitätenarrays

Grundlage vieler Arbeiten der Arbeitsgruppe 3D-Zellkultursysteme bilden die sogenannten Mikrokavitätenarrays (Abb. 1). Die Folien-basierten 3D-Zellkultursubstrate wurden am KIT entwickelt und vereinen viele Vorteile in sich, wie Dünnwandigkeit, damit verbundendene hohe Transparenz, definierte Position und vieles mehr. Die Systeme sind erfolgreich für die organotypische (Co-)Kultur von Leber-, Herz-, Darm- und vielen anderen Zelltypen verwendet worden und lassen sich in eigens dafür konzipierten Mikrobioreaktoren auch dynamisch kultivieren.

Abb. 1: Sensorarray für Sphäroid-/Organoidkulturen und simultaner Sauerstoffmessung in der direkten Mikroumgebung der Zellen

Einen äußerst wichtigen Parameter für die organotypische Kultur von Organoiden stellt die lokale Sauerstoffkonzentration dar. Diese konnte bislang aber nicht gemessen werden. Durch die Beschichtung der Array-Folie mit einem O₂-sensitiven Fluorophor ist es nun erstmals möglich die O₂-Konzentration Label-frei, in Echtzeit und ohne Analytverbrauch sowohl in der direkten Mikroumgebung der Zellen als auch z.B. zwischen den Mikrokavitäten zu messen. Damit lassen sich O₂-Gradienten in der Kultur bestimmen, die in globalen Sauerstoffmessungen nicht möglich sind. Darüber hinaus lässt sich die zelluläre Atmung nach Substanzgabe, z.B. von Atmungskettengiften, charakterisieren (Abb. 2). Ein sehr interessantes Feature dieser neuen Technologie ist die Tatsache, dass die Zellen keiner Hypoxie unterworfen werden müssen. Dies macht eine Beobachtung und Sauerstoffmessung der Zellen bereits vor dem Assay und eine Weiterkultivierung nach z.B. einem Mito Stress-Test so lange wie erforderlich möglich (mit bisherigen Systemen nicht möglich).

Abb. 2: Verlauf einer Sauerstoffmessung in einem Sensorarray (Mittelwert aller detektierten Mikrokavitäten) während eines mitochodrialen Stress-Tests. 4 μM oligomycin, 2 μM FCCP, and 1 μM of rotenone and antimycin A, wurden hinzugefügt. Die Sauerstoffwerte wurden mit nach oben offenen Mikrokavitäten gemessen weshalb es zu keinem geschlossenen Mikrokompartiment mit Sauerstoffmangel kommt. Der jeweilige Sphäroid in der Mikrokavität stellt ein Sauerstoff(post)diffusionsgleichgewicht mit dem Medium her, befindet sich also unter optimalen Kultivierungsbedingungen in einem stressfreien Zustand. Geschlossene Mikrokompartimente hingegen induzieren temporäre hypoxische (Stress-)Situationen, indem sie die Sauerstoff-Nachdiffusion abschneiden (z.B. OCR-Messungen Seahorse/Agilent). Auch der Messvorgang selbst kann bei Verwendung polarographischer Sensoren (Elektroden) zu Hypoxie führen. Methodisch oder sensorisch induzierte Hypoxie wird mit der neuen Methode vermieden. Zudem können hyperoxische Situationen durch Online-Monitoring erkannt und z.B. über Inkubatorbegasungsänderungen gesteuert werden. Im Ergebnis können die Sphäroide stressfrei und physioxisch kultiviert werden, so dass der durch die Testsubstanzen verursachte mitochondriale Stress optimal quantifiziert werden kann.